La historia evolutiva de los genes Brachyury en Hydrozoa implica duplicaciones, divergencias y neofuncionalización.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9382 (2023) Citar este artículo

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Brachyury, un miembro de la familia de genes T-box, es ampliamente conocido por su papel principal en la especificación del mesodermo en bilaterales. También está presente en metazoos no bilaterales, como los cnidarios, donde actúa como componente de un sistema de patrones axiales. En este estudio, presentamos un análisis filogenético de los genes de Brachyury dentro del filo Cnidaria, investigamos la expresión diferencial y abordamos un marco funcional de los parálogos de Brachyury en el hidrozoo Dynamena pumila. Nuestro análisis indica dos eventos de duplicación de Brachyury dentro del linaje cnidario. La primera duplicación probablemente apareció en el ancestro medusozoan, lo que resultó en dos copias en medusozoans, mientras que la segunda duplicación surgió en el ancestro hydrozoan, lo que resultó en tres copias en hydrozoans. Brachyury1 y 2 muestran un patrón de expresión conservador marcando el polo oral del eje del cuerpo en D. pumila. Por el contrario, la expresión de Brachyury3 se detectó en células probablemente nerviosas dispersas de la larva de D. pumila. Las modulaciones farmacológicas indicaron que Brachyury3 no está bajo la regulación de la señalización de cWnt en contraste con los otros dos genes de Brachyury. La divergencia en los patrones de expresión y la regulación sugieren una neofuncionalización de Brachyury3 en hidrozoos.

Brachyury (o T) es un miembro fundador de la familia de factores de transcripción T-box1 identificado por primera vez en una cepa de ratón mutante2. Los ratones que carecen de un alelo de Brachyury exhiben un fenotipo de cola corta3, mientras que la pérdida letal prenatal de ambos alelos conduce a graves deficiencias en la formación del mesodermo y la estructura axial4,5. Estudios posteriores demostraron que Brachyury está muy conservado y presente no solo en los cordados, sino también en la mayoría de los metazoos, desde ctenóforos hasta erizos de mar, así como en ictiosporeos, filastereos y varios hongos de ramificación temprana6,7,8,9.

Brachyury juega un papel crucial en la formación de notocorda en varios cordados (revisado en 10) y la especificación del mesodermo en bilateria en general (revisado en 11), y su función principal evolutiva posiblemente esté asociada con la demarcación de la capa germinal y la morfogénesis durante la gastrulación12,13. También es un componente importante de la red reguladora de genes de patrones axiales14.

Aunque las funciones de Brachyury se examinaron en un número limitado de especies, los patrones de su expresión durante el desarrollo embrionario están bien estudiados. Uno de los dominios de expresión de Brachyury se detecta de forma conservadora en un polo del eje corporal (p. ej., polo oral en cnidarios, polo posterior en deuteróstomos)15,16,17,18, donde el sitio de internalización celular también se encuentra en las gástrulas de La mayoría de los animales. Dentro de los hidrozoos, se demostró la expresión de Brachyury en el sitio de ingreso celular durante la gastrulación en los embriones de Clytia hemisphaerica19. Brachyury se expresa alrededor de un blastoporo en ctenóforos8, antozoos12,20, equinodermos21,22, amphioxus23 y todos los vertebrados investigados hasta ahora (revisado en 10), aunque este dominio de expresión se perdió en ascidias24. En anélidos, moluscos e insectos, la expresión de Brachyury también se asocia con el blastoporo, aunque este dominio de expresión se disuelve en varios grados (revisado en 11).

Una sola copia del gen Brachyury está presente en los genomas de la mayoría de los metazoos. Sin embargo, hay varias excepciones. Dentro de los cordados, Xenopus laevis tiene cuatro genes Brachyury 25,26, donde tbxt.L/tbxt.S (Xbra y Xbra2) y tbxt.2.L/tbxt.2.S (Xbra3) se consideran cada uno aloalelos, que surgen de la reciente duplicación del genoma25,26,27. X. tropicalis contiene dos genes Brachyury, uno de los cuales está agrupado con Xbra/Xbra2 (tbxt) y el otro corresponde al gen Xbra3 de X. laevis (tbxt.2)28. Los peces teleósteos, como el medaka, el pez cebra y el espinoso de tres espinas, poseen dos genes Brachyury (Bra y Ntl) en sus genomas28,29. Brachyury está presente en dos copias en el cordado basal amphioxus23,30,31. Según el análisis filogenético, los eventos de duplicación ocurrieron no en el ancestro cordado, sino en los tres linajes cordados de forma independiente28,32. Entre los metazoos no cordados, los hidrozoos Hydra y C. hemisphaerica tienen al menos dos copias del gen Brachyury13,33.

Se requiere un análisis filogenético exhaustivo para comprender la evolución de los genes de Brachyury dentro de los cnidarios, en particular, si se produjo la duplicación de genes en el antepasado hidrozoario común o si hubo varios eventos independientes específicos del linaje. Para resolver este problema, nuestro objetivo fue reconstruir el árbol filogenético de los genes Brachyury dentro del filo Cnidaria. Nuestros datos indican una primera duplicación de genes en el ancestro común de Meduzozoa. Sorprendentemente, Brachyury ha sufrido una duplicación más en el linaje de hidrozoos, donde encontramos tres parálogos de Brachyury en la mayoría de las especies. A continuación, el análisis de los patrones de expresión génica de los parálogos de Brachyury en el hidrozoo Dynamena pumila durante el desarrollo normal y en la colonia demostró una dinámica de expresión muy diferente de DpBra3 de la expresión de DpBra1 y DpBra2. Dado que se sabe que Brachyury es un gen objetivo directo de la vía cWnt33,34, probamos si los tres parálogos de Brachyury todavía están bajo la regulación de la señalización de cWnt. Los datos obtenidos de las modulaciones farmacológicas demuestran que DpBra3 se regula de manera diferente en comparación con DpBra1 y DpBra2. Tomados en conjunto, nuestros resultados sugieren que la duplicación de genes Brachyury resultó en la neofuncionalización de Brachyury3 en el linaje de hidrozoos.

Para abordar la evolución de la familia de genes Brachyury dentro de los cnidarios, primero realizamos una búsqueda TBLASTX del transcriptoma publicado anteriormente de D. pumila35 con las secuencias publicadas del gen Brachyury de C. hemisphaerica como consulta inicial. Recuperamos tres secuencias de genes similares a Brachyury del transcriptoma de D. pumila y los usamos como consultas para búsquedas de TBLASTX contra diez transcriptomas de medusozoos más (ver "Métodos"). Junto con cuatro secuencias de antozoos ya conocidas, se identificaron un total de 33 secuencias de Brachyury de 16 especies de Cnidaria.

Se generó un árbol de máxima verosimilitud usando secuencias de aminoácidos traducidas con el modelo JTT++ R5 de mejor ajuste (Fig. 1). Para este análisis, se utilizaron un total de 41 secuencias de Brachyury que representan todos los principales grupos de metazoos excepto Porifera. Dado que la familia de factores de transcripción T-box incluye clases de genes Tbx además de Brachyury9, se utilizaron secuencias de genes Tbx de metazoos como un grupo externo para enraizar el árbol. Para probar la robustez de la topología del árbol, también usamos el dominio conservador de caja T para la alineación. Se generó un árbol de máxima verosimilitud adicional con la misma topología general utilizando solo cajas T de secuencias analizadas (Información complementaria, Fig. S1).

Árbol filogenético ML de miembros de la familia Brachyury, enraizado con genes TBX. Los números en los nodos son valores de arranque, que se muestran como porcentajes. La escala indica la sustitución de aminoácidos esperada por sitio. Los genes de D. pumila están en negrita.

Todas las especies de antozoos analizadas poseen un solo gen Brachyury (Fig. 1). Sin embargo, nuestra encuesta transcriptómica reveló más genes Brachyury dentro de Medusozoa además de Brachyury1 (Fig. 1). Los genes Brachyury exclusivos de medusozoos pertenecen a los clados de cubozoos, escifozoos e hidrozoos. Se agrupan junto con los genes Brachyury/Brachyury1 con un soporte nodal alto (valor de arranque del 100 %). Los genes Brachyury2/3 de cubozoos y escifozoos se agrupan, y los genes Brachyury solo de hidrozoos forman un grupo hermano de ellos. A su vez, los genes Brachyury solo de hidrozoos incluyen dos grupos hermanos, Brachyury2 y Brachyury3, con un valor de arranque bien respaldado (88%) (Fig. 1). Curiosamente, una transcripción de Brachyury previamente estudiada (AJ428494.1) de Podocoryne carnea36 es ortóloga de Brachyury3 según nuestro análisis. Así, todas las especies de hidrozoos analizados tienen tres genes Brachyury, a excepción de Craspedacusta sowerbii e Hydra vulgaris, que carecen de Brachyury2 y Brachyury3, respectivamente.

Para un análisis más completo de los genes de Brachyury en Hydra, buscamos transcripciones de Brachyury en modelos de genes de ensamblajes de genomas de Hydra 2.0 (Hydra magnipapillata)37 e HydraAEP (Hydra vulgaris)38 con tubería PIA3 modificada, lo que nos permitió recuperar la clase de proteína T-box información automáticamente. Este análisis confirmó que los genomas de Hydra contienen solo dos genes Brachyury y varios genes T-box (consulte un ejemplo de salida de árbol en Información complementaria, Fig. S2). La búsqueda manual también recuperó solo dos genes Brachyury en Hydra. Todos estos resultados aumentan la probabilidad de que Hydra haya perdido Brachyury3.

La alineación de secuencias múltiples de las secuencias de aminoácidos de longitud completa deducidas de las proteínas Brachyury de D. pumila reveló que sus cajas T muestran una identidad de alrededor del 70-77%. Por el contrario, las secuencias de longitud completa tienen una identidad de aminoácidos más baja en general, por lo que las regiones restantes están menos conservadas (Fig. 2a, b).

Comparación de la conservación de la secuencia entre las proteínas Brachyury de hidrozoos deducidas. ( a ) Alineación de cajas T de proteínas Brachyury de D. pumila . Las identidades de los aminoácidos son azules, el azul claro indica que el residuo no es idéntico pero al menos similar al consenso de la columna. ( b ) Matriz de identidad porcentual de cajas T y proteínas Brachyury de longitud completa en D. pumila. Los colores aquí y debajo representan bandas de porcentaje de identidad: naranja, 40–49%; amarillo claro, 50–59%; amarillo brillante, 60–69%; menta, 70–79%; verde, 80–89%. ( c ) Arquitectura de dominio de las proteínas Brachyury de hidrozoo predichas. El cuadro rojo corresponde al dominio del represor R1. Un borde irregular indica que una coincidencia de secuencia no coincide con la longitud total del HMM que modela una entrada de pfam. Los números indican la longitud de la proteína en aminoácidos. ( d ) Porcentaje de matriz de identidad de proteínas Brachyury de hidrozoo de longitud completa.

Además, realizamos una alineación de secuencia múltiple de proteínas Brachyury deducidas, predicción de dominio funcional por hmmscan y una búsqueda del dominio represor R1 con una secuencia de R1 de H. vulgaris Brachyury1 como query33. Las proteínas Hydrozoan Brachyury1 comparten identidades más altas con genes homólogos en diferentes especies que Brachyury2 y Brachyury3 (Fig. 2c, d). Las identidades entre especies de Brachyury1 también fueron más altas que las identidades entre parálogos de Brachyury dentro de la misma especie (Fig. 2b, d). Solo las proteínas Brachyury1 tienen el fragmento de represión R1 en la región C-terminal (Fig. 2c, Información complementaria, Fig. S3). Las proteínas Scyphozoan y cubozoan Brachyury2/3 (Información complementaria Fig. S3) y las proteínas hydrozoan Brachyury2 y Brachyury3 (Fig. 2c) lo han perdido. La comparación de secuencias entre especies reveló además que de todas las proteínas Brachyury de hidrozoos analizadas, las proteínas Brachyury2 tienen las secuencias más cortas ubicadas en el extremo N de la caja T (por ejemplo, 20 aminoácidos para DpBra2), mientras que las proteínas Brachyury3 son las más diversas en longitud y longitud. identidad de aminoácidos entre hidrozoos (Fig. 2c, d).

Para determinar si los parálogos de Brachyury se expresan de manera diferente durante el desarrollo de D. pumila, analizamos la distribución espaciotemporal de sus transcripciones mediante hibridación in situ de montaje completo.

En D. pumila, la gastrulación es apolar y se produce principalmente a través de la epitelización de las células externas. Este modo de gastrulación provoca deformaciones de la superficie embrionaria y da como resultado múltiples concavidades y muescas. Por lo tanto, en la etapa media de la gástrula, múltiples superficies toroidales epitelizadas componen una superficie embrionaria. Estas deformaciones se suavizan hacia el final de la gastrulación, cuando solo quedan visibles algunas muescas. La última muesca tiende a ubicarse en el dominio oral del embrión. Sin embargo, esta última muesca no es homóloga a un blastoporo39. Al final de la gastrulación, la hibridación in situ reveló la expresión de DpBra1 en un amplio dominio unitario (Fig. 3a) que no se superponía con ninguna región específica dentro del embrión en etapa de gástrula. La señal se visualizó tanto en el ectodermo como en el endodermo (Fig. 3b, c). En la etapa de preplánula, la señal de expresión se detectó en parches discretos tanto en el ectodermo como en el endodermo, principalmente en el extremo oral del embrión (Fig. 3d, e). En la plánula temprana, observamos la expresión de DpBra1 en el tercio oral de la larva (Fig. 3f, g). En la plánula madura, DpBra1 se expresó en la mitad oral de la larva (Fig. 3h, i). En el ectodermo observamos dos dominios de expresión de DpBra1. En la punta, se visualizó una señal de expresión sesgada hacia el polo oral en los dominios apicales de las células ectodérmicas. Además, la expresión de DpBra1 fue visible en células ectodérmicas dispersas en el medio de la larva. En el endodermo, la expresión estaba presente en solo unas pocas células en el extremo oral (Fig. 3j). La figura 3k representa patrones de expresión de DpBra1 durante el desarrollo.

Patrones de expresión espacial de DpBra1 durante el desarrollo embrionario. (a) La expresión es evidente en un amplio dominio al final de la gastrulación. La punta de flecha blanca apunta a la abertura en el centro de la superficie toroidal. ( b, c ) Secciones transversales del embrión a través de los niveles indicados por las líneas punteadas blancas en ( a ). La expresión está presente tanto en el ectodermo (Ect) como en el endodermo (End). (d) Las células de expresión están ubicadas en el polo oral de la preplánula. La doble flecha muestra la dirección del eje del cuerpo oral-aboral (OA). ( e ) La señal de DpBra1 es prominente en el ectodermo y el endodermo de la preplánula se aclara con solución de Murray's Clear (MC). (f,g) Amplio dominio de expresión sesgado hacia el polo oral en la plánula temprana. (h) En la plánula madura, se observa expresión en el extremo oral y en células individuales en la mitad oral del cuerpo. (i) Sección longitudinal de la plánula a través del nivel indicado por la línea blanca punteada en (h). La expresión se localiza en el ectodermo oral casi exclusivamente. (j) Una ampliación de (i). La flecha negra indica una sola célula endodérmica con expresión de DpBra1. La línea punteada negra marca la lámina basal. ( k ) El esquema de patrones de expresión de DpBra1 durante el desarrollo.

La expresión de DpBra2 se detectó tanto en el ectodermo como en el endodermo al final de la gastrulación y también forma un dominio amplio (Fig. 4a, b). En la preplánula/plánula temprana, se observó expresión de DpBra2 en la mitad oral del embrión con una señal más prominente en el polo oral (Fig. 4c). Transcripciones concentradas en el citoplasma perinuclear de las células ectodérmicas (Fig. 4d). En la plánula madura, observamos la expresión de DpBra2 en el tercio oral de la larva con un sesgo hacia el polo (Fig. 4e, f). El ARN de DpBra2 se visualizó en dominios apicales de células ectodérmicas (Fig. 4g). La expresión también estuvo presente en células endodérmicas individuales (Fig. 4g) como en el caso de DpBra1 (Fig. 3j). La figura 4h representa los patrones de expresión de DpBra2 durante el desarrollo.

Patrones de expresión espacial de DpBra2 durante el desarrollo embrionario. (a) Amplio dominio de expresión al final de la gastrulación. La punta de flecha blanca apunta a la abertura en el centro de la superficie toroidal. (b) Gástrula aclarada con solución Murray's Clear (MC). La señal de expresión se detecta en las células internas del embrión. (c) Sesgado hacia el polo oral La expresión cubre la mitad de la preplánula/plánula temprana. La flecha doble muestra la dirección del eje del cuerpo oral-aboral (O-A). ( d ) Sección longitudinal del embrión a través del nivel indicado por la línea blanca punteada en ( c ). Los transcritos de DpBra2 se visualizan en el citoplasma perinuclear de las células ectodérmicas (Ect). Endodermo final. La línea punteada negra muestra la lámina basal. (e) La expresión oral está ligeramente sesgada hacia el polo en la plánula madura. (f) Sección longitudinal de la plánula a través del nivel indicado por la línea blanca punteada en (e). La expresión se localiza principalmente en el ectodermo oral. (g) Una ampliación de (f). Las transcripciones de DpBra2 se visualizan en los dominios apicales de las células ectodérmicas. La flecha negra indica una sola célula endodérmica con expresión de DpBra2. La línea punteada negra marca la lámina basal. ( h ) El esquema de patrones de expresión de DpBra2 durante el desarrollo.

DpBra3 se expresó en un amplio dominio al final de la gastrulación (Fig. 5a) en un patrón similar a los de DpBra1 y DpBra2. Sin embargo, el patrón de expresión de DpBra3 difería drásticamente en etapas de desarrollo posteriores. En la etapa de preplánula, la señal de DpBra3 era visible como un cinturón en el centro del eje oral-aboral (Fig. 5b, c). A medida que avanzaba el desarrollo, el área de expresión se expandió para cubrir la parte central de la plánula temprana (Fig. 5d). Las secciones longitudinales (Fig. 5e, f) revelaron que las transcripciones están presentes principalmente en los dominios basales de las células ectodérmicas dispersas. A medida que se alargaba la plánula, la expresión continuaba en la parte media de la larva en células ectodérmicas discretas (Fig. 5g, h). También apareció una señal débil en el endodermo aboral (Fig. 5g, h). Las secciones longitudinales de la plánula madura demostraron claramente que los cuerpos en forma de botella (Fig. 5i) y triangulares (Fig. 5j) de las células que expresan DpBra3 estaban ubicados directamente sobre la lámina basal o entre el endodermo y el ectodermo. Estos últimos probablemente migren hacia el ectodermo desde el endodermo (Fig. 5h). La Figura 5k representa patrones de expresión de DpBra3 durante el desarrollo.

Patrones de expresión espacial de DpBra3 durante el desarrollo embrionario. (a) Amplio dominio de expresión al final de la gastrulación. La punta de flecha blanca apunta a la abertura en el centro de la superficie toroidal. (b,c) La expresión forma un cinturón central que se muestra en el ectodermo de la preplánula. La flecha doble muestra la dirección del eje del cuerpo oral-aboral (O-A). ( d ) Las células que expresan son visibles como un cinturón central ancho en la plánula temprana. ( e, f ) Secciones longitudinales de la larva a través de los niveles indicados por las líneas punteadas blancas en ( d ). La expresión es estrictamente ectodérmica, la tinción se visualiza principalmente en los dominios de células basales. ( g ) La tinción intensa es visible en células dispersas en la región central de la larva madura. Se observa una tinción débil en el endodermo aboral. (h) Sección longitudinal de la plánula a través del nivel indicado por la línea blanca punteada en (g). Las células intensamente teñidas se encuentran en el ectodermo. (i,j) Explosiones de (h). Los cuerpos columnares y triangulares de las células que expresan se encuentran justo encima de la lámina basal. Endodermo ect, Endodermo final. La línea punteada negra marca la lámina basal. ( k ) El esquema de patrones de expresión de DpBra3 durante el desarrollo.

Además, examinamos los patrones de expresión de los tres genes Brachyury en los brotes de colonias de D. pumila. D. pumila forma colonias de crecimiento monopodial que poseen simetría biradial. Los brotes de la colonia están compuestos por módulos repetitivos. Cada módulo consta de un fragmento de brote en el centro y dos hidrantes a los lados (Fig. 6a). Se forman nuevos módulos en la parte superior debido a la repetición del ciclo morfogenético en el órgano específico: la punta de crecimiento del brote (Fig. 6b). La etapa 1 representa el estado en el que el ciclo morfogenético aún no ha comenzado (Fig. 6b1). En la etapa 2, el crecimiento comienza con la superficie apical de la punta curvándose hacia arriba (Fig. 6b2). En la etapa 3, la punta se alarga y adopta una forma semiesférica (Fig. 6b3). En la etapa 4, la punta de crecimiento se divide en una parte central y dos laterales (Fig. 6b4). Los primordios laterales se diferencian aún más en hidrantes, mientras que la parte central se convertirá en la punta de crecimiento del nuevo brote (Fig. 6b1*).

Patrones de expresión espacial de genes Brachyury en la colonia de D. pumila. (a) El retoño de la colonia de D. pumila. El corchete amarillo muestra la punta de crecimiento del brote (sgt), el corchete blanco: un módulo (mdl) del brote. h hidrante. (b) El esquema del ciclo morfogenético en la punta de crecimiento del brote de D. pumila. Los números del 1 al 4 indican etapas sucesivas de morfogénesis. Después de la formación del nuevo entrenudo, el ciclo comienza de nuevo (asterisco). ( c ) Patrones de expresión espacial de genes Brachyury en las puntas de crecimiento de los brotes en las etapas 2 y 4 del ciclo morfogenético. En la etapa 2, la expresión de DpBra1 es evidente en la parte apical central de la punta de crecimiento del brote. La expresión de DpBra2 es visible en los lados opuestos del ápice de la punta de crecimiento del brote. En el estadio 4, la expresión de DpBra1 es uniforme en el ápice. La expresión de DpBra2 permanece en los lados opuestos de la punta. Las flechas apuntan a las áreas de expresión. No se detectó la expresión de DpBra3. ( d ) Patrones de expresión espacial de genes Brachyury en hidrantes (montaje completo y sección longitudinal a través del centro del hidrante). La expresión de los genes Brachyury es evidente en el hipostoma del hidrante. Las puntas de flecha negras apuntan a la expresión en el endodermo. La punta de flecha roja apunta a la expresión en el ectodermo.

Analizamos los patrones de expresión de tres genes Brachyury en puntas de crecimiento de brotes en las etapas 2 y 4 del ciclo morfogenético y en hidrantes diferenciados completamente formados. Se detectó la expresión de DpBra1 y DpBra2 en el ectodermo apical de la punta de crecimiento (Fig. 6c). DpBra1 se expresa en la parte central del ápice en la etapa 2 y de manera uniforme en la etapa 4. La expresión de DpBra2 se observó en dos dominios en lados opuestos del ápice en las etapas 2 y 4. Por lo tanto, los dominios de expresión de DpBra1 y DpBra2 no se superponen en la etapa 2, pero se coexpresan en la etapa 4. No se detectó la expresión de DpBra3 en la punta de crecimiento del brote.

Se observó la expresión de tres genes Brachyury en el hipostoma del hidrante (Fig. 6d). Una sección longitudinal a través del centro del hydranth reveló que DpBra1 se expresaba tanto en el ecto como en el endodermo. La señal de DpBra2 era claramente visible en el endodermo del hipostoma, mientras que la presencia de una señal en el ectodermo no está clara. Desafortunadamente, la señal de DpBra3 era demasiado débil para el examen fino, pero parece expresarse en el ectodermo (visto desde la superficie).

Se demostró previamente en Hydra y C. hemisphaerica que dos genes Brachyury de hidrozoos, Brachyury1 y Brachyury2, están regulados por la señalización de cWnt13,33,40,41. Sin embargo, se desconoce si Brachyury3 sigue siendo un gen dependiente de cWnt después del evento de duplicación. Ensayamos la dependencia de tres genes Brachyury en la vía cWnt en D. pumila. Tratamos embriones en la etapa de gástrula con diferentes concentraciones de agentes farmacológicos para modular la vía cWnt, los cultivamos hasta la etapa de plánula y luego examinamos los patrones de expresión de tres genes Brachyury en larvas de plánula de D. pumila (Fig. 7). Azakenpaullone (Azk) activa la señalización de cWnt y iCRT14 la inhibe42,43,44. En un estudio anterior se demostró que la hiperactivación de la señalización de cWnt da como resultado la ampliación del dominio oral de las larvas, mientras que su inhibición conduce a la reducción del dominio oral en D. pumila39.

La expresión de DpBra1 y DpBra2, pero no de DpBra3, depende de la actividad de la vía de señalización de cWnt. Las modulaciones farmacológicas de la vía cWnt cambian el área de expresión de DpBra1 y DpBra2 en las larvas de plánula. También aumenta el número de células positivas para señal endodérmica (véanse los detalles de las secciones longitudinales). La hiperactivación de los resultados de cWnt en el dominio de expresión de DpBra3 se desplazó aboralmente. La inhibición de cWnt no afecta notablemente a la expresión de DpBra3. La punta de flecha apunta a las células que expresan DpBra3 en el polo oral de la larva (ver detalle). La flecha doble muestra la dirección del eje del cuerpo oral-aboral (O-A) para todas las larvas.

Las larvas tratadas con DMSO (control) tenían patrones de expresión y morfología normales de tres genes Brachyury (Fig. 7). Los tratamientos con concentraciones crecientes de Azk dieron como resultado la expansión gradual de los dominios de expresión DpBra1 y DpBra2. Después del tratamiento con Azk 2,5 μM, se observaron señales de expresión de DpBra1 y DpBra2 en toda la larva, excepto en la región más aboral. El número de células endodérmicas positivas para DpBra1 y Bra2 también aumentó. Viceversa, la inhibición gradual de la señalización de cWnt con iCRT14 condujo a la disminución de los dominios de expresión de DpBra1 y DpBra2 en el área (Fig. 7).

Sorprendentemente, la sobreactivación de la señalización de cWnt no condujo a la expansión del dominio de expresión de DpBra3. El cinturón de células que expresan DpBra3 se movió en más y más posiciones aborales, dejando vacante el dominio central. Como resultado del tratamiento con Azk 2,5 μM, se detectaron varias células que expresaban DpBra3 en el polo aboral de la larva (Fig. 7: punta de flecha). La inhibición de la señalización de cWnt no cambió notablemente el dominio de expresión de DpBra3 (Fig. 7).

Para descubrir las diferencias funcionales de tres genes de D. pumila Brachyury, empleamos el sistema de ensayo de gorra animal Xenopus laevis. Usando este ensayo, examinamos DpBra1, DpBra2 y DpBra3 por su capacidad para afectar el destino celular de las células cap de animales de Xenopus ingenuas. Se sabe que los sombreros de animales no tratados se diferencian en tejido epidérmico45, pero la inyección con ARNm de Xenopus Bra o Hydra Bra1 promueve la especificación del mesodermo, y el ARNm de Hydra Bra2 muestra actividad inductora neural33,46. Inyectamos ARNm protegidos que codifican DpBra1, DpBra2 o DpBra3 en la región animal de embriones en etapa de dos a cuatro células (~ 1 ng por embrión), diseccionamos las cubiertas animales en la etapa de blástula (etapa 8), las cultivamos hasta embriones de control alcanzó la etapa de neurula tardía (etapa 18) y examinó la expresión del gen marcador en estas tapas usando RT-PCR convencional o cuantitativa (qRT-PCR). Se usaron capuchones de animales no inyectados como grupo de control.

DpBra1 indujo significativamente (P < 0,0001) la expresión del gen marcador mesodérmico actc1.L (actina muscular) 47 (Fig. 8a), así como la expresión de otro gen marcador mesodérmico, myod.S47. Dado que la expresión de myod.S era demasiado baja para una cuantificación confiable en el grupo de control usando qRT-PCR, usamos electroforesis en gel para mostrar la inducción (Fig. 8c). DpBra1 no afectó la expresión del gen marcador neuronal tubb2b.S47 (Fig. 8b) mientras que DpBra2 y DpBra3 no afectaron la expresión de genes marcadores neuronales y mesodérmicos (Fig. 8).

Fenotipo molecular de sombreros de animales Xenopus inyectados con genes Brachyury de D. pumila. ( a, b ) Análisis de RT-qPCR sobre la inducción de actc1.L, myod2.S y tubb2b.S por ARNm de D. pumila Brachyury. Los datos se presentan como expresión de cambio de veces normalizada (media ± sd) en grupos experimentales. n valor n. El número de grupos experimentales es 3, 3 y 2 en (a); 3, 2 y 2 en (b). *** p < 0,001. ( c ) Electroforesis en gel para myod.S después de la inyección por ARNm de D. pumila Brachyury. Control negativo NC. L escalera de ADN. La punta de flecha apunta a la banda de 500 pb de la escalera de ADN. Consulte la imagen de gel no procesada en Información complementaria, Fig. S4.

Las duplicaciones de genes facilitan la evolución de genes reguladores, impulsando la expansión de familias de moléculas de señalización y factores de transcripción48,49. El evento de duplicación produce dos copias (parálogos) de un gen, los cuales son ortólogos al gen "padre". La evolución posterior puede dar lugar a divergencias: una copia conserva una gran similitud con sus ortólogos, mientras que la segunda sufre cambios estructurales y puede designarse como copia hija o hija50. En el presente estudio, se encontraron tres genes parálogos del factor de transcripción Brachyury en el linaje de hidrozoos. La reconstrucción filogenética sugiere que el primer evento de duplicación ocurrió antes de que el clado de hidrozoos se ramificara (en el ancestro común de los meduzosos o antes). La copia "hija" de la primera duplicación (Brachyury2/3) experimentó entonces un evento de duplicación adicional en el ancestro común de los hidrozoos (Fig. 1).

Hay tres escenarios principales después de la duplicación de genes. El primer resultado conduce a la pérdida de la función de la copia duplicada que se convierte en un pseudogen o se pierde. Otros dos resultados son la subfuncionalización y la neofuncionalización51,52. En caso de subfuncionalización, dos copias duplicadas comparten la función original del gen ancestral, y ambas son necesarias para conservar toda la función ancestral51,53. Los dominios de expresión superpuestos de dos duplicados a menudo reflejan una subfuncionalización51. En caso de neofuncionalización, una copia conserva sus funciones ancestrales, y la otra queda libre para adquirir una nueva función, ya que se relaja de la presión selectiva53, y muchas veces adquiere el dominio de expresión diferente del gen ancestral54,55. La adquisición de nuevas funciones por parte de los genes reguladores juega un papel clave en la diversificación de las vías de desarrollo y los planes corporales en los metazoos56,57. Es importante destacar que el mismo duplicado también puede mostrar características de sub y neofuncionalización con respecto a diferentes funciones58.

La evolución de Brachyury revela signos de sub y neofuncionalización. En los teleósteos, la expresión de dos genes Brachyury revela el patrón de cordados común28,59. Solo la pérdida simultánea de ambos genes Brachyury recapitula el fenotipo mutante de brachyury homocigoto de ratón4,28, lo que indica que la subfuncionalización siguió a la duplicación de Brachyury en teleósteos. Por el contrario, la neofuncionalización parece seguir la duplicación de Brachyury en X. laevis, ya que XBra3 (tbxt2.L/tbxt2.S) es distinto de XBra y XBra2 (tbxt,L/tbxt,S) en función y patrón espacio-temporal de expresión60. Dentro de los hidrozoos, los resultados de la duplicación de Brachyury se estudiaron previamente en Hydra33. Aunque ambos parálogos de Brachyury se expresan en el hipostoma de Hydra, desarrollaron secuencias de codificación distintas y divergieron en sus funciones. Los autores postulan que los parálogos de Brachyury muestran una mezcla de sub y neofuncionalización en Hydra33. Sin embargo, se desconoce si resultados similares han dado forma a las funciones de los genes Brachyury en otros cnidarios.

Los genes Brachyury están involucrados en el patrón axial también en otros cnidarios estudiados 14. En las especies de cnidarios con gastrulación polar, donde está ligado al patrón axial y ocurre en la región oral del embrión61, la expresión de Brachyury acompaña a los movimientos morfogenéticos de gastrulación12,19,20, 36. En la gastrulación de C. hemisphaerica, los parálogos de Brachyury (ChBra1 y ChBra2) muestran patrones superpuestos19 y son importantes para la progresión de la gastrulación13. En D. pumila durante la gastrulación, los tres parálogos de Brachyury se expresan en un amplio dominio (Figs. 3a, 4a, 5a). A diferencia de las especies de cnidarios con gastrulación polar12, es poco probable que los genes Brachyury proporcionen la demarcación del límite ecto-endodérmico en D. pumila, ya que la especificación de las capas germinales no está asociada con la polaridad axial y la región oral en particular durante la gastrulación en esta especie39.

La expresión predominantemente oral de los genes Brachyury continúa a lo largo del ciclo de vida de los cnidarios. Brachyury se expresa en faringe de larvas de antozoos12,20 y en el ectodermo oral de larvas de hidrozoos en C. hemisphaerica y D. pumila, donde se detecta la expresión de Brachyury1 y Brachyury219 (Figs. 3h–j, 4e–g). Sorprendentemente, los ortólogos de Brachyury3 no están asociados con tejidos orales en larvas de hidrozoos. Examinó previamente el ortólogo de Brachyury de P. carnea que se expresa en los grupos de ectodermo36 aboral según nuestro análisis con el grupo Brachyury3 (Fig. 1). En D. pumila, Brachyury3 muestra expresión en células ectodérmicas discretas triangulares y en forma de botella (Fig. 5g-j), morfológicamente similares a las células sensoriales del sistema nervioso cnidario62, aunque se sabe que Brachyury actúa como represor neural en el antozoo Nematostella14. Además, DpBra3 parece no ser dependiente de cWnt, lo que contrasta con la dependencia de Wnt informada de la expresión de Brachyury en cnidarios y bilaterales 14,63, incluidos DpBra1 y DpBra2 (Fig. 6). Los ortólogos de Brachury3 muestran una gran diversidad en longitud e identidad de aminoácidos entre la familia de genes de hidrozoos Brachyury (Fig. 2c, d). Las diferencias en las secuencias de proteínas, la regulación y los dominios de expresión sugieren que el Brachyury3 recién derivado divergió a diferentes funciones en las especies de hidrozoos.

En el hidrante de D. pumila, el patrón de expresión de DpBra3 no difiere drásticamente de los patrones de DpBra1 y DpBra2 y está en línea con estudios previos33,36,64,65. Los tres parálogos de Brachyury se detectaron en hipostoma de hidrante con patrones superpuestos (Fig. 6d). Probablemente, la función original de Brachyury en un hidrozoo hidrante está asociada con una especificación de un dominio oral (un hipostoma) como un todo. Al igual que en Hydra33, los dominios de expresión superpuestos de parálogos de Brachyury en hipostomas de hidrantes de D. pumila sugieren que se produjo una subfuncionalización51.

En la punta de crecimiento del brote de las colonias de D. pumila66, DpBra1 y DpBra2 se expresan fuertemente en su ectodermo apical (Fig. 6c), lo que podría considerarse un derivado del dominio oral larval. La asociación de la expresión de DpBra2 con la formación de primordios de hidrante indica su nueva función en los primordios de hidrante en D. pumila.

La especificidad de la función de Brachyury está definida principalmente por los dominios N- y C-terminal, pero no por la caja T central9,67. En línea con estudios previos33 y nuestros datos (Fig. 8), la alta conservación funcional de los ortólogos de hidrozoo Brachyury1 es consistente con la alta conservación de la secuencia de proteínas (Fig. 2c). Sin embargo, nuestros datos indican la divergencia funcional de Brachyury2 y Brachyury3. En los ensayos de caperuza animal de Xenopus, DpBra2 y DpBra3 no provocaron una mayor expresión de los marcadores mesodérmicos actc1.L o myod.S (Fig. 8a, c). En Brachyury2 y Brachyury3, los dominios N- y C-terminal muestran una menor identidad de aminoácidos con el gen ancestral y han perdido el dominio R1 de represión C-terminal ancestral (Fig. 2a-c). Estas diferencias en los dominios terminales podrían ser responsables de la neo y subfuncionalización de Brachyury2 y Brachyury3 en hidrozoos, aunque se sugirió que ocurren principalmente debido a mutaciones en las secuencias reguladoras, más que a mutaciones en la secuencia codificante68.

En conjunto, nuestros datos indican dos eventos de duplicación de Brachyury en cnidarios. Brachyury1 es el duplicado más conservador, tanto a nivel funcional como de secuencia. En los hidrozoos estudiados y en D. pumila en particular, se supone que conserva su función ancestral como componente crucial de la formación y el patrón del eje. Hydrozoan Brachyury 2 y Brachyury 3 revelan características de sub y neofuncionalización. Sin embargo, Brachyury3 muestra una fuerte divergencia en la secuencia y funciones entre los hidrozoos. Nuestros datos sobre Brachyury respaldan el modelo de un límite indistinto entre la subfuncionalización y la neofuncionalización y los resultados complejos para los genes duplicados 58, y proporcionan un modelo prometedor para los estudios sobre escenarios posteriores a la duplicación.

Se realizaron muestreos de colonias de D. pumila y procedimientos experimentales sobre embriones de D. pumila en la Estación Biológica del Mar Blanco de Pertsov (Universidad Estatal Lomonosov de Moscú) (Bahía de Kandalaksha; 66°340 N, 33°080 E) durante el período de D. pumila reproducción sexual (junio-julio). Las colonias sexualmente maduras se mantuvieron en agua de mar natural a +10–12 °C. Las observaciones de montaje completo se realizaron con un microscopio estereoscópico Leica M165C.

Para activar/inhibir la señalización de cWnt, los embriones gastrulados se trataron con 1-Azakenpaulone 0,5/1/2,5 μM (Sigma, Canadá/China) o iCRT-14 1/2,5/10 μM (Sigma, EE. UU./China), respectivamente. Las soluciones madre se prepararon con DMSO a 10 mM, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20 °C. Las soluciones de trabajo se prepararon antes de su uso mediante la dilución de las soluciones madre en agua de mar filtrada (FSW) hasta la concentración final. Los embriones de control se expusieron a DMSO al 0,1 % en FSW. Las soluciones de trabajo se actualizaron diariamente. La incubación se realizó en la oscuridad.

Para analizar las relaciones filogenéticas dentro de la familia de genes brachyury, examinamos 28 especies de metazoos. Las secuencias de genes se obtuvieron de varias fuentes (Tabla de información complementaria S1). Las secuencias de bilaterales, ctenóforos, placozoos y antozoos se obtuvieron de la colección de nucleótidos de la base de datos NCBI. Some assembled cnidarian transcriptomes were downloaded from public databases at NCBI (Aurelia aurita, Morbakka virulenta, Nemopilema nomurai, Podocoryna carnea, Lucernaria quadricornis, Tripedalia cystophora69, Dynamena pumila35, Polypodium hydriforme70 or other web-sites (Clytia hemisphaerica71, Hydractinia symbiolongicarpus72), Hydra38) . Los transcriptomas de Craspedacusta sowerbii y Margelopsis haeckelii fueron ensamblados recientemente por nosotros mismos. Los datos de Margelopsis haeckelii se recopilaron y secuenciaron de novo y están disponibles en nuestro laboratorio. El control de calidad de lectura se realizó con el software fastp (v.0.20.0)73. Los transcriptomas de novo se ensamblaron con el software rnaSPAdes (v.3.13.1)74. La calidad del ensamblaje se evaluó mediante BUSCO v.3.0.2 con base de datos de metazoos75.

Los genes Brachyury ABJ16449.1 y JAC85032.1 de C. hemisphaerica se utilizaron como consultas para la búsqueda local tblastx de genes Brachyury en el transcriptoma de D. pumila. Usando tres secuencias obtenidas de genes similares a Brachyury de D. pumila como consultas, buscamos genes similares a Brachyury en otros diez transcriptomas de medusozoos. Examinamos 12 transcriptomas de medusozoos en total (Tabla de información complementaria S1). También utilizamos secuencias de genes de Brachyury bilaterales, ctenóforos, placozoos y antozoos.

Las secuencias de nucleótidos sin secuencia de proteína correspondiente en la base de datos NCBI se tradujeron utilizando Transdecoder v5.5.0. La búsqueda de T-boxes en las secuencias analizadas se realizó con la herramienta de búsqueda de dominios conservados del NCBI. Las alineaciones de secuencias de aminoácidos y el análisis filogenético se realizaron con el algoritmo MUSCLE en el software MUSCLE (v3.8.31)76. Las secuencias de genes Tbx se seleccionaron como un grupo externo. Las alineaciones de secuencia se recortaron eliminando las regiones mal alineadas con la herramienta TrimAL, v.1.2rev5977. Se utilizó un enfoque heurístico "automatizado1" para seleccionar el mejor método automático para recortar nuestras alineaciones. El recorte se realizó sin ajuste manual. El análisis filogenético se realizó con Máxima Verosimilitud utilizando el software IQTree v.2.0-rc278. Se encontró que el modelo JTT + R5 era óptimo. Para evaluar los soportes de las ramas, se calcularon los valores de arranque ejecutando 1000 repeticiones usando un arranque ultrarrápido (UFBoot)79. Los árboles se visualizaron en el software FigTree v1.4.4. Los árboles filogenéticos obtenidos se procesaron con Adobe Illustrator CC. No se hicieron correcciones a la topología del árbol ni a las longitudes de las ramas.

Buscamos transcripciones de Brachyury en modelos genéticos de ensamblajes de genoma Hydra 2.0 e HydraAEP utilizando la canalización de anotaciones con información filogenética PIA380. La canalización PIA3 se modifica de PIA281 y está disponible en GitHub82. Las modificaciones nos permitieron recuperar automáticamente la información de clase de proteína T-box.

Para analizar los dominios funcionales del hidrozoo Brachyury, las secuencias de proteínas seleccionadas se escanearon contra la base de datos del modelo oculto de Markov (HMM) de Pfam usando hmmscan de HmmerWeb v.2.41.183. La identificación del dominio R1 conservado dentro del hidrozoo Brachyury se llevó a cabo utilizando el servicio de alineación de secuencias ClustalW84 con el dominio R1 en HyBra133 como consulta. La arquitectura de dominio de las proteínas se visualizó utilizando Pfam85. La alineación de secuencias múltiples y el cálculo de la matriz de identidad de las proteínas Brachyury de hidrozoos y las cajas T de D. pumila Brachyury se realizaron utilizando ClustalW con configuraciones predeterminadas y sombreadas con BOXSHADE 3.21.

La biblioteca de expresión de ADNc se preparó mediante el enfoque SMART a partir de ARN embrionario total con un kit de síntesis de ADNc Mint (Evrogen, Rusia). Los fragmentos de genes de ADNc se aislaron de la biblioteca mediante PCR con cebadores específicos de genes (consulte la Tabla 1). Los cebadores se diseñaron en base a las secuencias obtenidas del transcriptoma secuenciado (Illumina) de D. pumila35. Los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pAL-TA (Evrogen, Rusia). Se generaron sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina a partir de fragmentos de genes, que se amplificaron a partir de plásmidos con genes de D. pumila.

El protocolo de hibridación in situ se realizó como se describió previamente en 66 para brotes e hidrantes de D. pumila y en 39 para embriones de D. pumila. Se utilizó un método de hibridación in situ basado en urea para los hidrantes86.

Los brotes se fijaron con glutaraldehído al 0,2 %/formaldehído al 4 % en FSW durante 1 min y luego durante una hora más con formaldehído al 4 % en FSW. Las muestras se lavaron con PTw (1x PBS con Tween 20 al 0,1 %) tres veces y se almacenaron en metanol al 100 % como máximo durante la noche a -20 °C hasta la hibridación. Los embriones se fijaron con paraformaldehído al 4 % en FSW durante la noche a +4 °C, se enjuagaron con PBS y se almacenaron a -20 °C en metanol al 100 % hasta la hibridación.

Las muestras se rehidrataron con PTw y se trataron con proteinasa K (80 μg/ml, 22 °C) durante 1–3 min. Para inactivar la fosfatasa alcalina endógena y evitar un resultado falso positivo, las muestras se calentaron a +80 °C durante 30 min. La hibridación se realizó a 62 °C (brotes) o 58 °C (embriones) con sondas de ARN antisentido marcadas con digoxigenina (1 ng/μL). Se utilizaron anticuerpos conjugados con fosfatasa alcalina anti‐DIG (Roche; diluido 1/2000) y sustrato NBT/BCIP (Roche) para detectar la sonda. Las muestras teñidas se lavaron con PTw y metanol para reducir la tinción de fondo y se montaron en glicerol (87 %).

Se trataron varios especímenes con solución Murray's Clear (mezcla 2:1 de benzoato de bencilo y alcohol bencílico) para lograr la limpieza del tejido óptico. Se incrustaron varios especímenes en resina Technovit. Las secciones (de 5 a 7 μm de espesor) se cortaron con el ultramicrótomo Reichert-Jung (Leica) Ultra-cut 701701 (Reichert-Jung, Austria). La obtención de imágenes de las muestras se realizó utilizando un microscopio Leica M165C (Leica, alemán) equipado con una cámara digital Leica DFC420C (5,0 MP).

Los Xenopus laevis de tipo salvaje se obtuvieron del Centro Europeo de Recursos de Xenopus (EXRC) en la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad de Portsmouth, Reino Unido, o Xenopus 1, EE. UU. El mantenimiento y cuidado de las ranas se llevó a cabo de acuerdo con los procedimientos estándar en las instalaciones de AquaCore, University Freiburg, Medical Center (RI_00544) y en base a las recomendaciones proporcionadas por los centros de recursos comunitarios internacionales Xenopus NXR y EXRC, así como por Xenbase (http://www. xenbase.org/, RRID:SCR_003280). Este trabajo se realizó de conformidad con las leyes alemanas de protección animal y fue aprobado bajo el Registro Nr. G-18/76 por el estado de Baden-Württemberg.

Se recolectaron huevos de X. laevis y se fertilizaron in vitro, luego se cultivaron y se microinyectaron mediante procedimientos estándar87. Los embriones se inyectaron dos veces por embrión con ARNm en la etapa de dos o cuatro células utilizando una configuración de PicoSpritzer en solución de Ringer de rana modificada (MR) 1/3x con 2,5 % de Ficoll PM 400 (GE Healthcare, n.° 17-0300-50 ), y se transfirieron después de la inyección a 1/3x MR que contenía Gentamicina. El tamaño de la gota se calibró en alrededor de 7 a 8 nL por inyección. Se cultivaron embriones inyectados o no inyectados (control) hasta st. 8. Los sombreros de los animales se diseccionaron en solución de Barth modificada (MBS) 1x y se transfirieron a MBS 0,5x + gentamicina. Se recolectaron de 10 a 15 organoides en TRIzol por condición y experimento.

Las secuencias de Brachyury de D. pumila de longitud completa se amplificaron a partir de la biblioteca de ADNc y se clonaron en el plásmido pCS2 + 8. pCS2 + 8 fue un regalo de Amro Hamdoun (Addgene plásmido #34931; http://n2t.net/addgene:34931; RRID:Addgene_34931)88. Los ARNm se prepararon con el kit Ambion mMessage Machine usando Sp6 (#AM1340) complementado con inhibidor de ARNasa (Promega #N251B) después de la linealización del plásmido con Not1, y se inyectaron a 50 ng/μl.

El ARN total se extrajo usando un protocolo Trizol estándar (Invitrogen #15596026) y se usó para la síntesis de ADNc con el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad #1708891). Las reacciones de qPCR se realizaron utilizando Sso Advanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad n.º 172-5275) en un CFX Connect Real-Time System (Bio-Rad) en placas de PCR de 96 pocillos (marca n.º 781366). La PCR convencional y la electroforesis en gel se realizaron de manera análoga en un termociclador S1000 (Bio-Rad). Consulte la Tabla 1 para los cebadores específicos de genes.

Los valores de expresión se normalizaron frente a dos genes de control de mantenimiento: EF1 y ODC (método 2∆∆Ct). Los resultados se presentan como medias ± desviación estándar (sd) del cambio de pliegue relativo (rFC), que es una proporción del nivel de ARNm normalizado de la expresión génica analizada en el grupo experimental en comparación con el grupo de control.

El análisis estadístico de los datos de expresión génica normalizados después de qRT-PCR se realizó en el software GraphPad Prism 5. La normalidad de la distribución de datos se comprobó mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov. Las diferencias entre los grupos se evaluaron con ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Dunnet. La importancia se indica mediante asteriscos en los gráficos. Un valor de P inferior a 0,05 se consideró significativo para todos los análisis. Todos los experimentos se diseñaron con condiciones de control coincidentes para permitir la comparación estadística. El valor de n es 7 para un grupo de control. El valor de n para cada grupo experimental se indica en gráficos.

Las imágenes fueron editadas con los programas Adobe Photoshop CS6. Para lograr una exposición y un contraste óptimos, se usaron alteraciones en "Brillo", "Contraste", "Exposición" y "Niveles" para el canal RGB. Todas las herramientas se aplicaron a toda la imagen, no localmente.

Las secuencias obtenidas en este estudio se han depositado en GenBank (OP828770–OP828776, OP902368, OP902367).

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Agradecemos a NA Pertsov White Sea Biological Station de la Universidad Estatal de Moscú por la ayuda y el apoyo para obtener muestras y brindar acceso a todas las instalaciones y equipos necesarios del "Centro de Microscopía WSBS MSU". Agradecemos al Dr. Amro Hamdoun por el plásmido pCS2+8 (plásmido Addgene n.° 34931).

El trabajo en el laboratorio de Walentek cuenta con el apoyo de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bajo el Programa Emmy Noether (subvención WA3365/2-2) y bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania (CIBSS-EXC-2189-Project ID 390939984). SK cuenta con el apoyo del proyecto No. 0088-2021-0009 del Instituto Koltzov de Biología del Desarrollo de la RAS. El estudio del patrón molecular de la colonia de D. pumila fue financiado por RFBR, número de proyecto 20-04-00978a (para SK).

Laboratorio de Evolución de la Morfogénesis, Instituto Koltzov de Biología del Desarrollo RAS, Vavilova 26, Moscú, 119334, Rusia

Alexandra A. Vetrova y Stanislav V. Kremnyov

Departamento de Embriología, Facultad de Biología, Universidad Estatal Lomonosov de Moscú, Leninskiye Gory 1/12, Moscú, 119234, Rusia

Daria M. Kupaeva y Stanislav V. Kremnyov

Instituto de Ciencia y Tecnología de Austria (ISTA), Am Campus 1, 3400, Klosterneuburg, Austria

alena kizenko

Departamento de Evolución y Desarrollo Molecular, Centro de Biología de Sistemas de Organismos, Universidad de Viena, Althanstraße 14, 1090, Viena, Austria

Tatiana S. Lebedeva

División Renal, Medicina Interna IV, Centro Médico, Facultad de Medicina, Universidad de Friburgo, 79106, Friburgo, Alemania

pedro san valentin

CIBSS-Centro de Estudios Integrativos de Señalización Biológica, Universidad de Friburgo, 79104, Friburgo, Alemania

pedro san valentin

Instituto de Anatomía y Embriología, Centro Médico Universitario de Göttingen, Kreuzbergring 36, 37085, Göttingen, Alemania

Nikoloz Tsikolia

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AAV realizó los experimentos, realizó un análisis de secuencias, realizó un análisis estadístico, interpretó los resultados, escribió el borrador del manuscrito y preparó las figuras. DMK ensambló transcriptomas y realizó un análisis filogenético de secuencias completas de proteína Brachyury. AK buscó genes de Brachyury en los genomas de Hydra utilizando una canalización de anotaciones con información filogenética. TSL participó en la realización de experimentos. PW realizó un ensayo de casquete animal y una RT-PCR cuantitativa. NT participó en la visualización de datos. SVK conceptualizó, diseñó y supervisó el estudio, realizó los experimentos, el análisis filogenético de los dominios T-box e interpretó los resultados. Todos los autores leyeron, revisaron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Stanislav V. Kremnyov.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Vetrova, AA, Kupaeva, DM, Kizenko, A. et al. La historia evolutiva de los genes Brachyury en Hydrozoa implica duplicaciones, divergencias y neofuncionalización. Informe científico 13, 9382 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35979-8

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Recibido: 20 enero 2023

Aceptado: 26 de mayo de 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35979-8

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